Odprawienie mszy świętej było dla Ojca Pio centrum jego zakonnego życia. Z pokorą i po wcześniejszym przygotowaniu zbliżał się do ołtarza, by odprawić mszę świętą, czyli ponowić Mękę Jezusa Chrystusa. Kulminacyjnym punktem sprawowania Najświętszej Eucharystii było Przeistoczenie. W owej chwili Stygmatyzowany Zakonnik ponawiał Boską tragedię Kalwarii; łkania i płacz poprzedzały odczuwanie okrutnych mąk Jezusa Ukrzyżowanego. Msza święta Ojca Pio różniła się tym od wszystkich innych odprawianych na świecie, że on rzeczywiście ponawiał mękę Jezusa Chrystusa, stając się żywą żertwą ofiarną. Fizycznie był przy ołtarzu, lecz duchowo był tuż przy Jezusie, z Nim rozmawiał, nad Nim płakał i dla Niego cierpiał, błagając za dusze sprawiające Mu cierpienie. Wszyscy, którzy uczestniczyli w jego mszy świętej, stawali się bardziej skupieni, bardziej ożywieni w sercu i bardziej szczerzy, jak gdyby oderwali się od tej ziemi i oddali się kontemplacji niewidzialnego świata.